Tác giả: Nguyễn Thị Lan Anh1*, Lưu Quang Minh3,Nguyễn Thị Kim Ngân2, Nguyễn Ngọc Tấn2 và Hoàng Tuấn Thành1

 

1 Phân Viện Chăn nuôi Nam Bộ

 

2Khoa Khoa học Sinh học – Trường Đại học Nông Lâm – Tp. Hồ Chí Minh 3 Bộ Khoa học và Công nghệ

 

* Tác giả liên hệ: ThS. Nguyễn Thị Lan Anh, Phân Viện Chăn nuôi Nam Bộ; ĐT: 0969300386; Email: lananh303@gmail.com.

 

Ngày nhận bài báo: 22/03/2021 – Ngày nhận bài phản biện: 12/04/2021

 

Ngày bài báo được chấp nhận đăng: 24/04/2021

 

TÓM TẮT

 

Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm đánh giá đa dạng di truyền giống vịt Hòa Lan (HL) vàmột số giống vịt khác (vịt TC – con lai giữa vịt Triết Giang và vịt Cỏ, vịt Biển -BI và vịt Cỏ -CO). Mẫu máu được thu thập ngẫu nhiên từ 199 cá thể, trong đó có 51 HL, 58 TC, 30 BI và 52 CO và 20 chỉ thị microsatellite (MS) được sử dụng để phân tích đa dạng di truyền các giống vịt trong nghiên cứu. Kết quả cho thấy trong tổng số 20 MS có 15 MS biểu hiện đa hình ở các nhóm giống vịt khảo sát. Số alen trung bình của mỗi MS có đa hình dao động từ 3,0 (AJ272582) đến 6,5 alen (AJ515883).

 

Tính biến đổi di truyền trong cùng giống ở mức cao với hệ số di hợp mong đợi trung bình là 0,682, giá trị trung bình của hệ số dị hợp tử quan sát trên mỗi locus dao động từ 0,0553 (AJ2725770) đến 0,7538 (AJ515893) với giá trị trung bình là 0,352. Trung bình giá trị ước lượng Fis cho tất cả các giống vịt từ 0,034 (AJ515893) đến 0,913 (AJ272577), trung bình giá trị ước lượng Fst ở mức thấp nhất là 0,0268 (AJ272580) và cao nhất là 0,1449 (AJ272581). Dựa vào cây phân loài cho thấy từ 4 quần thể vịt khảo sát chia thành hai nhánh chính, trong đó một nhánh là nhóm giống vịt BI, nhánh còn lại là các nhóm giống vịt CO, TC và HL. Các chỉ thị có đa hình trong nghiên cứu được xem là chỉ thị hữu ích để ứng dụng phân tích đa dạng di truyền các quần thể vịt ở Việt Nam. Từ nguồn vật liệu trong nghiên cứu này, nên tiến hành các nghiên cứu sâu hơn trên ADN ty thể để tìm hiểu sự phân nhóm một cách chính xác hơn giữa các giống vịt hiện diện ở Việt Nam.

 

Từ khóa: Đa dạng di truyền, khoảng cách di truyền, vịt bản địa, chỉ thị microsatellite, cây phân loài.

 

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

 

Việt Nam là quốc gia có ngành chăn nuôi vịt lớn thứ 2 thế giới, sau Trung Quốc. Tổng đàn vịt cả nước năm 2020 là 82,5 triệu con, trong đó tập trung chủ yếu (trên 60%) ởhai vùng đồng bằng sông Cửu Long và sông Hồng. Trong các giống vịt bản địa đang đặc biệt được quan tâm phải kể đến giống vịt Hòa Lan nuôi khá phổ biến trong các nông hộ ở vùng đồng bằng sông Cửu Long. Đây là giống vịt bản địa đã có từ lâu đời, được người dân ưa chuộng do có nhiều đặc điểm quý hiếm như sức sống tốt, chất lượng thịt và trứng thơm ngon nhưng chưa được quan tâm nghiên cứu một cách đồng bộ để sử dụng có hiệu quả nguồn gen giống vịt này.

 

Có nhiều loại chỉ thị ADN được sử dụng trong các nghiên cứu đa dạng di truyền nhưng phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử microsatellite (MS) vẫn được xem là công cụ hữu hiệu cho công tác bảo tồn nguồn gen nhờ tính đa hình cao, phân bố ngẫu nhiên trên toàn hệ gen, thông tin di truyền hữu ích và có tính phân biệt di truyền rất cao (Estoup và ctv, 1993). Tuy nhiên, một số hạn chế của MS do ảnh hưởng tạo sản phẩm phụ trong quá trình nhân bản gen cũng như phương pháp phân tích cũng đã được đưa ra trong một số nghiên cứu gần đây (Brookes và ctv, 2012; Hosseinzadeh-Colagar và ctv, 2016). Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu đa dạng di truyền bằng chỉ thị MS làm cơ sở cho việc bảo tồn nguồn gen được thực hiện trên bò (Phạm Doãn Lân, 2012); dê (Nguyễn Thị Lan Anh và ctv, 2019); vịt (Đỗ Ngọc Hà và ctv, 2018); trâu nội (Nguyễn Ngọc Tấn và ctv, 2019) nhưng chưa có nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền ở vịt Hòa Lan so với các giống vịt bản địa khác. Nghiên cứu này nhằm đánh giá khoảng cách di truyền của vịt Hòa Lan cùng với một số giống vịt khác bằng chỉ thị phân tử microsatellites, từ đó cung cấp thông tin hữu ích cho việc định hướng bảo tồn cũng như khai thác và phát triển nguồn gen vịt Hòa Lan một cách có hiệu quả.

 

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

 

2.1. Vật liệu

 

Mẫu máu được lấy từ tĩnh mạch cánh của từng cá thể vịt, cho vào ống nghiệm có EDTA, bảo quản ở 4ºC đưa về phòng thí nghiệm (TN) và được bảo quản ở -20ºC để sử dụng.

 

Thí nghiệm được thực hiện tại phòng TN Công nghệ Sinh học – Phân Viện Chăn nuôi Nam Bộ, từ tháng 7/2018 đến tháng 12/2018.

 

2.2. Phương pháp

 

Thu nhận mẫu và ly trích ADN: Tổng số 199 mẫu máu cá thể được thu thập ngẫu nhiên từ vịt Hòa Lan (HL; 59), vịt TC (con lai giữa vịt Triết Giang và vịt Cỏ; 58), vịt Biển (BI; 30), và vịt Cỏ (CO; 52) tại các trại vịt giống thuộc Phân viện Chăn nuôi Nam Bộ. Ly trích ADN bằng kit tách chiết của hãng Qiagen (Đức) theo quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất và ADN sau tách chiết được kiểm tra chất lượng bằng phương pháp điện di và phương pháp quang phổ (UV).

 

Phát hiện đa hình microsatellite: sử dụng 20 chỉ thị microsatellite được chọn lọc từ nghiên cứu của Wu và ctv (2008), chi tiết về từng primer được trình bày trong Bảng 1. Tất cả các cặp mồi được tối ưu với ADN được ly trích từ 2 mẫu cá thể bất kì của các quần thể vịt khác nhau để xác định nhiệt độ gắn mồi phù hợp. Sau khi tối ưu được nhiệt độ gắn mồi thích hợp, phản ứng PCR-SSR được thực hiện trên toàn bộ mẫu khảo sát cho từng chỉ thị. Tất cả mẫu được nhận dạng di truyền bằng 20 chỉ thị microsatellite (Bảng 1), tổng thể tích mỗi phản ứng PCR là 10µl, với chu trình nhiệt: (1) 94ºC trong 3 phút, (2) 94ºC 1 phút, (3) Ta trong 30 giây, (4) 72Cº trong 30 giây, (5) Lặp lại 35 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4, (6) 72ºC trong 5 phút. (7) giữ nhiệt độ 4ºC trong 10 phút. Trong đó Ta là nhiệt độ bắt cặp của từng cặp mồi sau khi đã tối ưu hóa.

(Bảng 1).

 

Các sản phẩm PCR khuếch đại được điện di trên gel agarose 3% và chụp hình ảnh điện di bằng máy GelDoc It2 (UVP, USA) để phân tích kết quả. Xác định kích thước alen theo phương pháp của Barker và ctv (1997) có sự điều chỉnh là so sánh với thang ADN chuẩn HyperLadderTM (50bp) của Bioline (Anh).

 

2.3. Xử lý số liệu

 

Sau khi điện di sản phẩm PCR, đọc kết quả và mã hóa dữ liệu theo hình thức nhị phân, có đa hình ghi “1” và đồng hình ghi “0”. Dữ liệu kiểu gen được phân tích sử dụng phiên bản Popgene 1.32 để tính toán tần số alen tại mỗi locus cho mỗi quần thể, số lượng alen trung bình trên quần thể và độ dị hợp tử (mong đợi và quan sát). Các thông số khác biệt di truyền (Fst), hệ số di truyền nội loài (Fis) và trong toàn bộ quần thể (Fit) được phân tích theo phương pháp của Wright (1965). Sử dụng phương pháp Neighbor Joining (Saitou và Nei, 1987) để tính khoảng cách di truyền, xây dựng cây phân loài (phylogenetic tree) bằng phần mềm NTSYSpc phiên bản 2.1.

 

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

 

3.1. Nhận biết đa dạng di truyền các giống vịt bằng chỉ thị microsatellite

 

Thực hiện phản ứng PCR cho tất cả mẫu cá thể trong nghiên cứu theo từng primer. Kếtquả phân tích 20 chỉ thị microsatellite với 199 mẫu cá thể, tính toán số lượng alen của mỗi microsatellite có đa hình trong từng nhóm giống được tổng hợp ở Bảng 2.

Bảng 2. Số alen của mỗi microsatellite đa hình

 

Với 20 chỉ thị đã sử dụng thì có 15 chỉ thị có đa hình trong các quần thể vịt nghiên cứu, trong đó chỉ thị AJ272581 cho kết quả đơn hình ở quần thể vịt Biển. Số lượng alen trung bình của từng chỉ thị MS có đa hình tính trên 4 quần thể vịt khảo sát dao động từ 3,0 alen ở locus AJ272582 đến 6,5 alen ở locus AJ515883. Kết quả cho thấy mức đa dạng ở tất cả các quần thể khá cao với tổng số alen cao nhất ở quần thể vịt TC (82 alen) và thấp nhất là ở quần thể vịt BI (66 alen). Nghiên cứu của Wu và ctv (2008) trên 6 giống vịt được nuôi ở Trung Quốc (Peking Z4, Aobaixing, Cherry Valley, Muscovy, Shaoxing và Peking Z1) cho thấy tất cả 20 MS trên đều cho kết quả đa hình ngoại trừ AJ515896 ở quần thể Muscovy và sốalen lần lượt là 151, 156, 163, 171, 175 và 176 alen.

Sự khác nhau này có thể do sự khác biệt nguồn vật liệu di truyền giữa hai nghiên cứu Kết quả ở bảng 3 cho thấy giá trị Hexp ở các quần thể vịt CO, TC, HL và BI lần lượt là 0,658; 0,701; 0,728 và 0,641. Giá trị Hobs ở quần thể vịt là tương đương nhau và dao động từ 0,313 (CO) đến 0,391 (BI). Giá trị thông tin đa hình (PIC) ở các quần thể vịt cao nhất là 0,722 (HL) và thấp nhất là 0,631 (BI). Giá trị trung bình của Hexp, Hobs và PIC cho tổng các chỉ thị có đa hình và tính cho toàn bộ các quần thể vịt trong nghiên cứu lần lượt là 0,682; 0,356 và 0,675. 20 MS được sử dụng trên các quần thể vịt tại Trung Quốc cho thấy Hexp (0,7843) và PIC (0,762) cao hơn kết quả nghiên cứu này (Wu và ctv, 2008). Giá trị PIC của tất cả 15 MS đa hình đều cho giá trị cao hơn 0,5. Điều này chứng tỏ bộ MS sử dụng có độ đa dạng cao và có thể ứng dụng để phân tích đánh giá mối quan hệ di truyền ở mức độ phân tử giữa các quần thể vịt khác nhau tại Việt Nam.

 

Số lượng alen là tương đối cao ở tất cả các MS đa hình, cao nhất tại 2 locus AJ515883 và AJ515890 (7 alen), tiếp theo sau đó là 6 alen ở 6 locus (AJ272578, AJ515884, AJ515889, AJ515891, AJ515893, AJ51589902), kế tiếp là 5 alen tại 06 locus khác (AJ272577, AJ272580, AJ515887, AJ515895, AJ515896 và AJ515898) và thấp nhất ở locus AJ272581 (4 alen). Số lượng alen, Hexp, Hobs và PIC là các hệ số đolường cơ bản, cung cấp thông tin quan trọng cho sự phân biệt giữa các cá thể và quần thể (Seo và ctv, 2016). Số lượng alen của một locuscàng lớn thì mức độ mang thông tin của chỉ thị càng cao và quần thể nào có tần số xuất hiện các alen càng đều nhau thì mức độ đa hình của quần thể đó cũng cao hơn (Nguyễn Thị Diệu Thúy và Geldermann, 2004). Kết quả từ nghiên cứu này cho thấy có 08 locus có từ 6alen trở lên có thể ứng dụng cho các nghiên cứu sâu hơn trên các giống vịt được nuôi ởViệt Nam và có thể là cơ sở dữ liệu để xây dựng nên các giải pháp để tác động lên các chương trình lai tạo giống vịt trong tương lai.

Ghi chú: Na: Số lượng alen; Hexp: hệ số dị hợp mong đợi; Hobs: hệ số dị hợp quan sát; PIC: thông tin đa hình; Fst(θ): Khoảng cách di truyền, Fit(F): Tổng cận huyết, Fis(f): Lai cận huyết giữa các giống

 

Giá trị PIC trung bình của 15 chỉ thị microsatellite là 0,7164 (0,6095 AJ5158980,8425 AJ515883), trừ AJ272581 có giá trị 0,4178. Độ dị hợp tử quan sát (Hobs) trên mỗi locus trung bình là 0,3521 (0,0553 AJ2725770-0,7538 AJ515893). Độ dị hợp mong đợi (Hexp) trungbình là 0,7182, thấp nhất tại locus AJ272581 (0,4189) và cao nhất ở locus AJ515883 (0,8446).

 

Như vậy, giá trị Hobs ở tất cả các locus khảo sát đều thấp hơn Hexp, chỉ ra sự suy giảm dị hợp tử trong các quần thể vịt nghiên cứu. Theo Botstein và ctv (1980), PIC và He là các chỉ số đáng tin cậy được sử dụng để đánh giá về đa dạng di truyền, đánh giá mức biến đổi gen: khi PIC>0,5 và He>0,6 locus có sự đa dạng cao; khi PIC<0,25 locus có sự đa dạng thấp và khi 0,25<PIC<0,5 locus có sự đa dạng trung bình.

 

Trong nghiên cứu này, hệ số PIC của các chỉ thị đều cho giá trị >0,5 (ngoại trừ locus AJ272581), cho thấy độ đa dạng di truyền dựa trên các chỉ thị MS cho các nhóm vịt khảo sát trong nghiên cứu ở mức cao.

 

Thống kê F được sử dụng để kiểm tra sự khác biệt di truyền giữa các quần thể. Khi không có sự khác biệt, giá trị của Fst bằng 0; khi các alen giữa các quần thể khá khác biệt, giá trị của Fst bằng 1 (Wu và ctv, 2008). Số liệu Bảng 4 cho thấy hầu hết các locus đều có giá trị Fis dương, với giá trị trung bình là 0,4743 (trừ locus AJ515893 có giá trị -0,0340). Giá trị Fis lớn thể hiện sự suy giảm dị hợp tử và ngược lại. Sự suy giảm dị hợp tử có thể do mức độ giao phối cận huyết cao và nguyên nhân có thể là (i) các cá thể giao phối tự nhiên; (ii) kích thước quần thể nhỏ, số lượng đực giống ít hay là sự phân tán địa lý còn giới hạn do giao thương con giống giữa các vùng (Taberlet và ctv, 2008).

 

Sự khác biệt di truyền trung bình giữa các nhóm giống (Fst) đạt 0,0539 là khá thấp và giá trị tổng cận huyết (Fit) đạt ở mức cao 0,5026. Điều này có thể do hạn chế của kỹ thuật điện di agarose so với diện di trên acrylamide (Đỗ Ngọc Hà và ctv, 2018) hay điện di mao quản (Phạm Doãn Lân, 2012) và những ảnh hưởng phụ xảy ra trong quá trình khuếch đại sản phẩm cùng với phương thức điện di trên gel agarose khi ứng dụng chỉ thị MS (Harr và ctv, 2000; Brookes và ctv, 2012; Hosseinzadeh[1]Colagar và ctv, 2016).

 

3.2. Khoảng cách di truyền và cây phân loài

 

Kết quả Bảng 5 cho thấy khoảng cách di truyền giữa các nhóm giống vịt là nhỏ, và giá trị nhỏ nhất được tìm thấy là giữa các cặp nhóm giống TC và CO (0,0269), tiếp theo là giữa HL và TC (0,0336); HL và CO (0,0363), cao nhất là HL và BI (0,0639).

Bảng 5. Ma trận khoảng cách di truyền giữa các quần thể vịt

 

Kết quả ở Hình 1 cho thấy, 4 quần thể vịt đang khảo sát đều xuất phát cùng nguồn gốc và chia thành 2 nhánh, trong đó: 1 nhánh là vịt BI, nhánh còn lại là vịt CO, TC và HL. Điều này cũng phù hợp với thực tế khi vịt Biển được chọn tạo nhằm thích nghi với điều kiện chăn nuôi ở vùng nước mặn. Ở nhánh còn lại, vịt HL tách thành 1 nhóm, vịt CO và TC 1 nhóm và giữa hai giống vịt này tách thành 2 nhóm phụ. Tuy nhiên, mối quan hệ giữa vịt HL với CO và TC cần được tìm hiểu và nghiên cứu thêm.

4. KẾT LUẬN

 

Có thể ứng dụng bộ 15 chỉ thị cho kết quả đa hình trong đánh giá đa dạng di truyền các giống vịt được nuôi ở Việt Nam. Có sự suy giảm dị hợp tử cao giữa các quần thể vịt khảo sát. Quan hệ di truyền giữa ba giống vịt HL, CO và TC gần gũi nhau hơn so với vịt BI. Các quần thể vịt trong nghiên cứu đều xuất phát cùng nguồn gốc và chia thành hai nhánh: một nhánh là giống vịt BI, nhánh còn lại là vịt CO, TC và HL. Vịt HL tách thành một nhóm, vịt CO và TC một nhóm, và sau đó giữa hai giống vịt CO và TC tách thành hai phân nhóm phụ.

 

LỜI CẢM ƠN

 

Nghiên cứu được tài trợ kinh phí trong khuôn khổ nhiệm vụ Khoa học và Công nghệ quỹ gen cấp quốc gia “Nghiên cứu nâng cao năng suất và sử dụng có hiệu quả nguồn gen vịt Hòa Lan tại Đồng bằng sông Cửu Long“ thuộc Chương trình bảo tồn và sử dụng bền vững nguồn gen đến năm 2025, định hướng đến năm 2030.

 

TÀI LIỆU THAM KHẢO

 

1. Nguyễn Thị Lan Anh, Nguyễn Thị Ngọc Phúc, Nguyễn Thị Kim Ngân, Nguyễn Ngọc Tấn, Lã Văn Kính và Hoàng Tuấn Thành (2019). Đa dạng di truyền các giống dê nội và nhập ngoại tại Ninh Thuận dựa trên chỉ thị Microsatellite. Tạp chí KHKT Chăn nuôi,242: 9-14.

2. Barker J.S.F., Moore S.S., Hetzel D.J.S., Evans D., Tan S.G. and Byrne K. (1997). Genetic diversity ofAsian water buffalo (Bubalus bubalis): microsatellite variation and a comparison with protein-coding loci. Ani. Gen., 28: 103-15.

3. Botstein D., White R.L., Skolnik M. and Davis R.W. (1980). Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Hum. Genet. 32: 314-31.

4. Brookes C., Bright J.A., Harbison S. and Buckleton J. (2012). Characterising stutter in forensic STR multiplexes. Forensic Sci. Int. Genet., 6: 58-63.

5. Estoup A., Presa P., Krieg F., Vaiman D. and Guyomard R. (1993). (CT)n and (GT)n microsatellites: a new class of genetic markers for Salmo trutta L. (brown trout). Heredity, 71: 488-96.

6. Đỗ Ngọc Hà, Nguyễn Văn Duy, Nguyễn Bá Mùi, Hoàng Văn Chính, Lê Thị Hà và Lê Văn Sơn (2018).

Phân tích sự sai khác di truyền của vịt Cổ Lũng với một số giống vịt Nội bằng chỉ thị phân tử SSR. Tạp chí KHKT Chăn nuôi, 233(6): 2-8.

7. Harr B, Zangerl B, Schlötterer C. 2000. Removal of microsatellite interruptions by DNA replication slippage: phylogenetic evidence from Drosophila. Mol. Bio. Evo., 17: 1001-09.

8. Hosseinzadeh-Colagar A., Haghighatnia M.J., Amiri Z., Mohadjerani M. and Tafrihi M. (2016). Microsatellite (SSR) amplification by PCR usually led to polymorphic bands: Evidence which shows replication slippage occurs in extend or nascent DNA strands. Mol. Bio. Res. Commun. 5(3): 167-74.

9. Phạm Doãn Lân (2012). Nghiên cứu sự khác biệt di truyền của các nhóm bò Vàng địa phương bằng chỉ thị phân tử. Báo cáo tổng hợp kết quả khoa học công nghệ đề tài.

10. Nei M. (1978). Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals. Genetics. 89(3): 583-90.

11. Saitou N. and Nei M. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Bio. Evo. 4: 406-25.

12. Seo D., Bhuiyan M.S.A., Sultana H., Heo J.M. and Lee J.H. (2016). Genetic divesity analysis of South and East Asian duck populations using highly polymorphic microsatellite markers. Asian Aust J. Ani. Sci., 29: 471-78.

13. Taberlet P., Vallentini A., Rezaei H.R., Naderi S., Pompanon F., Negrini, R. and Ajmone-Marsan P. (2008). Are cattle, sheep, and goat endangered species? Mol. Ecol., 17(1): 275-84.

14. Nguyễn Ngọc Tấn, Nguyễn Thị Kim Ngân, Hoàng Tuấn Thành, Võ Phạm Kha Bích Ngân, Phan HữuHương Trinh, Nguyễn Thị Lan Anh và Phạm Công Thiếu (2019). Đa đạng di truyền một số quần thể trâu nội Việt Nam. Tạp chí KHKT Chăn nuôi, 242: 2-8.

15. Nguyễn Thị Diệu Thúy và Geldermann H. (2004. Đa dạng di truyền một số giống lợn nội Việt Nam và Châu Âu dựa trên chỉ thị microsatellite. Tạp chí khoa học ĐHQGHN, KHTN & CN, XX(4).

16. Wu F., Yinghua H., Ying M., Shengqiang H., Jinping H. and Ning L. (2009). Evaluation of genetic diversity and relationships within and between two breeds of duck based on microsatellite markers. Pro. Nat. Sci., 19:1581-86.

17. Wu Y., Liu X.L., Hou S.S. and Huang W. (2008). Study on genetic diversity of six duck populations with microsatellite DNA. Asian-Aust J. Ani. Sci., 21: 776-83.

 

Nguồn: Hội Chăn nuôi Việt Nam