Tác giả: Suh J, Oh T, Park K, Yang S, Cho H, Chae C. Pathogens. 2021 Jul 14;10(7):891.

 

Tóm tắt:

 

Mục đích của nghiên cứu này là so sánh độc lực của kiểu gen Circovirus týp 2 (PCV2) ở heo bị gây nhiễm từng chủng PCV2 của cả ba kiểu gen (a, b và d) hoặc đồng thời với virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp type 2 (PRRSV-2) ở heo so với heo được tiêm riêng từng chủng PCV2 kiểu gen (a, b và d). Sự khác biệt được ghi nhận ở hàm lượng PCV2 trong máu, mức độ nghiêm trọng của tổn thương phổi và hạch bạch huyết, và lượng kháng nguyên PCV2 trong các hạch bạch huyết bị tổn thương. Bất kể kiểu gen PCV2 là gì, những con heo bị gây nhiễm đồng thời PCV2/PRRSV-2 có điểm số lâm sàng cao hơn đáng kể, mức tăng cân trung bình hàng ngày ít hơn, nồng độ PCV2 trong máu cao hơn, và các tổn thương hạch bạch huyết nghiêm trọng hơn so với những con heo chỉ bị gây nhiễm đơn lẻ PCV2. Trong số các nhóm heo bị gây nhiễm đồng thời, heo nhiễm PCV2d/PRRSV-2 có nồng độ PCV2 trong máu cao hơn đáng kể, tổn thương phổi và bạch huyết nghiêm trọng hơn, và tế bào dương tính với PCV2 nhiều hơn trong các bạch huyết có bệnh tích so với heo được gây nhiễm đồng thời PCV2a/PRRSV-2 hay PCV2b/PRRSV-2. Kết quả của nghiên cứu này đã chứng minh sự khác biệt đáng kể về độc lực giữa việc nhiễm kép PCV2a/PRRSV-2, PCV2b/PRRSV-2 và PCV2d/PRRSV-2. Dựa theo mức độ vi rút PCV2 trong máu và sự hình thành các tổn thương bạch huyết liên quan đến PCV2, không ghi nhận sự khác biệt ý nghĩa về độc lực giữa các nhóm heo chỉ bị gây nhiễm đơn lẻ PCV2a, PCV2b hoặc PCV2d.

 

Từ khoá: bệnh liên quan với porcine circovirus, porcine circovirus type 2, kiểu gien PCV2, virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo.

 

1. Đặt vấn đề

 

Circovirus type 2 (PCV2) và vi-rút hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở heo (PRRSV) tiếp tục là mầm bệnh quan trọng nhất ở heo hiện nay và là nguyên nhân gây thiệt hại kinh tế to lớn cho ngành chăn nuôi heo toàn cầu. PCV2 là một loại virus DNA sợi đơn vòng, không có vỏ bọc, thuộc chi Circovirus trong họ Circoviridae [1]. Ít nhất tám kiểu gen riêng biệt (PCV2a đến PCV2h) đã được xác định [2]. PCV2 là căn nguyên chính của một số bệnh và hội chứng được gọi chung là bệnh liên quan đến circovirus ở heo (PCVAD) [3].

 

PRRSV là một loại vi rút ARN dương tính chuỗi đơn, có vỏ bọc, thuộc chi Porarterivirus trong họ Arteriviridae [4]. PRRSV được chia thành hai loài, PRRSV-1 (trước đây được gọi là kiểu gen 1 của Châu Âu) và PRRSV-2 (trước đây được gọi là kiểu gen 2 của Bắc Mỹ) [4]. Nhiễm PRRSV có thể gây rối loạn sinh sản (sẩy thai, heo con yếu và chết non, vô sinh) ở heo nái và bệnh hô hấp ở heo cai sữa và heo choai [5].

 

Hiện tại, PCV2a, PCV2b và PCV2d là ba kiểu gen chính [2]. Trong số này, PCV2d là kiểu gen chiếm ưu thế nhất hiện đang lưu hành trong quần thể heo châu Á và Bắc Mỹ, tiếp theo là PCV2b và PCV2a [6,7,8]. Khi so sánh về độc lực, chủng PCV2d của Trung Quốc gây bệnh nghiêm trọng hơn so với các chủng PCV2a và PCV2b; trong khi đó chủng PCV2d của Hàn Quốc và Bắc Mỹ thể hiện độc lực tương tự như các chủng PCV2a và PCV2b [9,10,11]. Những nghiên cứu so sánh trước đây chỉ được thực hiện với các ca bệnh nhiễm đơn lẻ [9,10,11]. Do đó, kết quả có thể bị hạn chế, vì mặc dù PCV2 là tác nhân chính, nhưng cần có thêm mầm bệnh để gây ra PCVAD. Đồng nhiễm PCV2 và PRRSV ở heo là dạng kết hợp phổ biến nhất, gây ra đầy đủ các dấu hiệu lâm sàng và bệnh tích liên quan đến PCVAD, đặc biệt là ở những đàn không được tiêm phòng PCV2 [12,13,14,15,16,17 ]. Đây là lý do tại sao cần phải tiến hành gây nhiễm kép PCV2 và PRRSV để so sánh độc lực giữa ba kiểu gen chính của PCV2. Mục tiêu của nghiên cứu này là so sánh độc lực của ba kiểu gen PCV2 chính (2a, 2b và 2d) ở heo bị gây nhiễm đồng thời PCV2a và PRRSV-2, PCV2b và PRRSV-2, hoặc PCV2d và PRRSV-2, cùng với heo bị gây nhiễm đơn lẻ PCV2a, PCV2b hoặc PCV2d.

 

2. Kết quả

 

2.1 Dấu hiệu lâm sàng

 

Biểu hiện hô hấp nhẹ (thở nhanh) đã được quan sát thấy ở những con heo chỉ được tiêm PCV2a, PCV2b hoặc PCV2d. Thể bệnh lâm sàng được quan sát thấy ở tất cả heo bị gây nhiễm đồng thời PCV2a/PRRSV-2, PCV2b/PRRSV-2 hoặc PCV2d/PRRSV-2. Bất kể kiểu gen PCV2 là gì, heo bị gây nhiễm song song PCV2/PRRSV đã xuất hiện tình trạng suy hô hấp nghiêm trọng ở ngày thứ bảy sau gây nhiễm và kéo dài đến ngày 21 sau gây nhiễm. Điểm số triệu chứng hô hấp ở ngày 7 đến 21 sau gây nhiễm ở heo bị gây nhiễm đồng thời PCV2a/PRRSV-2, PCV2b/PRRSV-2 hoặc PCV2d/PRRSV-2 cao hơn đáng kể (p < 0,05) so với heo bị gây nhiễm đơn lẻ PCV2a, PCV2b, hoặc PCV2d và ở heo đối chứng không bị gây nhiễm. Thở nhanh và thở bụng rõ rệt lần đầu tiên được quan sát thấy ở ngày 5 sau gây nhiễm. Không có biểu hiện hô hấp lâm sàng nào được quan sát thấy ở heo đối chứng âm tính trong toàn bộ thí nghiệm (Hình 1A).

 

Nhiệt độ trực tràng trung bình tăng cao trong giai đoạn biểu hiện lâm sàng rõ nhất cho đến 7 ngày sau gây nhiễm, sau đó nhiệt độ duy trì mức bình thường. Nhiệt độ trực tràng ở heo từ ngày 1 đến 7 sau gây nhiễm đồng thời PCV2a/PRRSV-2, PCV2b/PRRSV-2 hoặc PCV2d/PRRSV-2 cao hơn đáng kể (p < 0,05) so với nhiệt độ trực tràng của heo chỉ bị  gây nhiễm đơn PCV2a, PCV2b, hoặc PCV2d và của heo đối chứng âm tính (Hình 1B).

 

2.2 Năng suất tăng trưởng

 

Không có sự khác biệt thống kê lúc bắt đầu thí nghiệm (heo 42 ngày tuổi) về trọng lượng cơ thể trung bình giữa bảy nhóm. Ở 63 ngày tuổi (21 sau gây nhiễm), heo bị gây nhiễm đồng thời PCV2a/PRRSV-2, PCV2b/PRRSV-2 hoặc PCV2d/PRRSV-2 có trọng lượng cơ thể trung bình thấp hơn đáng kể so với heo chỉ bị gây nhiễm đơn PCV2a, PCV2b hoặc PCV2d, cũng như heo đối chứng âm tính.

 

Heo bị gây nhiễm đồng thời PCV2a/PRRSV-2, PCV2b/PRRSV-2 hoặc PCV2d/PRRSV-2 có ADWG từ 42 đến 63 ngày tuổi thấp hơn đáng kể (p < 0,05) so với heo chỉ bị gây nhiễm đơn PCV2a, PCV2b, PCV2d hoặc heo đối chứng âm tính (Bảng 1).

 

2.3 Xét nghiệm ELISA

 

Không có sự khác biệt đáng kể về chỉ số S/P đối với PCV2 giữa heo bị gây nhiễm PCV2 đơn lẻ và heo bị gây nhiễm đồng thời PCV2 và PRRSV (Hình 2A). Kháng thể PCV2 không phát hiện ở heo đối chứng âm tính trong toàn bộ thí nghiệm. Kháng thể PRRSV đã được phát hiện ở heo gây nhiễm đồng thời PCV2 và PRRSV. Không có sự khác biệt đáng kể về chỉ số S/P đối với PRRSV giữa heo bị gây nhiễm đồng thời PCV2 và PRRSV (Hình 2B).

 

 

2.4 Định lượng DNA của PCV2 trong máu

 

Trước khi gây nhiễm, tất cả các mẫu huyết thanh được thu thập từ heo trong bảy nhóm đều cho kết quả âm tính với PCV2a, PCV2b và PCV2d. Ở 7, 14 và 21 ngày sau khi gây nhiễm với PCV2, DNA của PCV2 được phát hiện trong máu ở tất cả heo trong nhóm bị gây nhiễm đồng thời (PCV2a/PRRSV-2, PCV2b/PRRSV-2 hoặc PCV2d/PRRSV-2) và gây nhiễm đơn (PCV2a, PCV2b hoặc PCV2d). Heo bị gây nhiễm đồng thời PCV2a/PRRSV-2, PCV2b/PRRSV-2 hoặc PCV2d/PRRSV-2 có số lượng bản sao DNA của PCV2 cao hơn đáng kể (p < 0,05) so với heo bị gây nhiễm đơn PCV2a, PCV2b hoặc PCV2d tại thời điểm 7, 14 và 21 ngày sau khi gây nhiễm. Heo bị gây nhiễm đồng thời PCV2d/PRRSV-2 có số lượng bản sao DNA của PCV2 cao hơn đáng kể (p < 0,05) so với heo bị gây nhiễm đồng thời PCV2a/PRRSV-2 hoặc PCV2b/PRRSV-2 ở 14 và 21 ngày sau khi gây nhiễm (Hình 3). Không phát hiện được bản sao DNA của PCV2 ở heo đối chứng âm tính trong toàn bộ thí nghiệm.

 

2.5 Định lượng cDNA của PRRSV trong máu

 

Trước khi gây nhiễm, tất cả các mẫu huyết thanh được thu thập từ heo trong bảy nhóm đều cho kết quả âm tính với PRRSV. Ở 7, 14 và 21 ngày sau khi gây nhiễm PRRSV, bản sao cDNA PRRSV-2 đã được phát hiện trong máu của tất cả heo trong các nhóm bị gây nhiễm đồng thời (PCV2a/PRRSV-2, PCV2b/PRRSV hoặc PCV2d/PRRSV). Không có sự khác biệt đáng kể về số lượng bản sao cDNA của PRRSV-2 được phát hiện ở heo trong các nhóm PCV2a/PRRSV-2, PCV2b/PRRSV-2 và PCV2d/PRRSV-2. Không phát hiện được bản sao cDNA PRRSV-2 ở heo đối chứng âm tính trong toàn bộ thí nghiệm.

 

2.6 Mô bệnh học

 

Các tổn thương mô bệnh học tối thiểu đã được ghi nhận ở heo con bị gây nhiễm đơn PCV2a, PCV2b hoặc PCV2d. Tổn thương mô bệnh học ở heo bị gây nhiễm đồng thời PCV2a/PRRSV-2, PCV2b/PRRSV-2 hoặc PCV2d/PRRSV-2 ở mức nghiêm trọng và lan rộng tại các hạch bạch huyết. Tổn thương nguyên phát là viêm u hạt lan tỏa, chủ yếu ở các hạch bạch huyết và lách, đôi khi ở thận. Sự xâm nhập của các tế bào lympho, bạch cầu trung tính và bạch cầu ái toan kèm theo đại thực bào ở mức vừa đến nghiêm trọng. Hạch bạch huyết bị sụt giảm nghiêm trọng các tế bào lympho trưởng thành; các trung tâm tế bào mầm bị giảm hoặc không có. Các tế bào khổng lồ đa nhân chiếm đa số ở heo bị gây nhiễm đồng thời PCV2a/PRRSV-2, PCV2b/PRRSV-2 hoặc PCV2d/PRRSV-2 (Hình 4A). Heo bị gây nhiễm đồng thời PCV2a/PRRSV-2, PCV2b/PRRSV-2 hoặc PCV2d/PRRSV-2 bị viêm phổi kẽ. Vách phế nang dày lên rõ rệt do thâm nhiễm đại thực bào, tế bào lympho và tương bào. Vách phế nang chứa đầy các tế bào phổi loại 2. Khoảng gian bào phế nang chứa một lượng nhỏ các mảnh vụn hoại tử. Các mẫu mô từ heo đối chứng âm tính đều bình thường.

 

 

 

Heo bị gây nhiễm đồng thời PCV2a/PRRSV-2, PCV2b/PRRSV-2 hoặc PCV2d/PRRSV-2 có điểm số tổn thương phổi vi thể cao hơn đáng kể (p < 0,05) so với heo bị gây nhiễm đơn PCV2a, PCV2b hoặc PCV2d ở 21 ngày sau gây nhiễm. Heo bị gây nhiễm đồng thời PCV2d/PRRSV-2 có điểm số tổn thương phổi vi thể cao hơn đáng kể (p < 0,05) so với heo bị gây nhiễm đồng thời PCV2a/PRRSV-2 hoặc PCV2b/PRRSV-2 ở 21 ngày sau gây nhiễm (Bảng 2).

 

Heo bị gây nhiễm đồng thời PCV2a/PRRSV-2, PCV2b/PRRSV-2 hoặc PCV2d/PRRSV-2 có điểm tổn thương bạch huyết vi thể cao hơn đáng kể (p < 0,05) so với heo bị gây nhiễm đơn PCV2a, PCV2b hoặc PCV2d ở 21 ngày sau gây nhiễm. Heo bị gây nhiễm đồng thời PCV2d/PRRSV-2 có điểm tổn thương bạch huyết vi thể cao hơn đáng kể (p < 0,05) so với heo bị gây nhiễm đồng thời PCV2a/PRRSV-2 và PCV2b/PRRSV-2 ở 21 ngày sau gây nhiễm (Bảng 2).

 

 

2.7 Hoá mô miễn dịch

 

Bất kể kiểu gen của PCV2 là gì, tất cả heo nhiễm PCV2, đơn lẻ hoặc kết hợp với PRRSV đều cho kết quả dương tính với kháng nguyên PCV2. Trong các hạch bạch huyết, kháng nguyên virus được phát hiện chủ yếu trong các đại thực bào nang ở các trung tâm mầm bị hư hại (Hình 4B). Heo bị gây nhiễm đồng thời PCV2a/PRRSV-2, PCV2b/PRRSV-2 hoặc PCV2d/PRRSV-2 có số lượng tế bào dương tính với PCV2 trên một đơn vị mô trong hạch bạch huyết cao hơn đáng kể (p < 0,05) so với heo bị gây nhiễm đơn lẻ PCV2a, PCV2b hoặc PCV2d. Heo bị gây nhiễm đồng thời PCV2d/PRRSV-2 có số lượng tế bào dương tính với PCV2 trên một đơn vị mô trong hạch bạch huyết cao hơn đáng kể (p < 0,05) so với heo bị gây nhiễm đồng thời PCV2a/PRRSV-2 và PCV2b/PRRSV-2 (Bảng 2). Không phát hiện được kháng nguyên PCV2 trong bất kỳ hạch bạch huyết nào được kiểm tra ở heo đối chứng âm tính.

 

2.8 Tương quan giữa PCV2 máu và bệnh tích hạch

 

Mối tương quan thuận và có ý nghĩa giữa tải lượng vi rút PCV2 trong máu và mức độ nghiêm trọng của tổn thương bạch huyết đã được ghi nhận ở heo bị gây nhiễm đồng thời PCV2 và PRRSV (PCV2a/PRRSV-2: R = 0,926, p < 0,05; PCV2b/PRRSV-2: R = 0,837, p < 0,05; PCV2d/PRRSV-2: R = 0,833, p < 0,05).

 

3. Thảo luận

 

Trong nghiên cứu hiện tại, bất kể kiểu gen PCV2 là gì, heo bị gây nhiễm kép PCV2/PRRSV đã phát triển thành PCVAD, trong khi không có con heo nào bị gây nhiễm PCV2 đơn lẻ phát triển thành PCVAD. Hơn nữa, sự khác biệt đáng kể về độc lực đã được ghi nhận ở những heo bị gây nhiễm đồng thời PCV2a/PRRSV-2, PCV2b/PRRSV-2 hoặc PCV2d/PRRSV-2, trong khi không có sự khác biệt đáng kể nào về độc lực được tìm thấy ở những con heo chỉ bị gây nhiễmđơn  PCV2a, PCV2b hoặc PCV2d. Chủng PCV2d có độc lực cao hơn cả chủng PCV2a hoặc PCV2b trong mô hình gây nhiễm đồng thời, bằng chứng là tải lượng vi rút PCV2 trong máu tăng lên và các tổn thương dạng bạch huyết có mức độ nghiêm trọng hơn. Nghiên cứu thử nghiệm này không chứng minh được sự khác biệt lớn về độc lực của PCV2a/PRRSV-2 và PCV2b/PRRSV-2 trong mô hình gây nhiễm đồng thời. Những kết quả này phù hợp với những phát hiện trước đó cho thấy, không có sự khác biệt đáng kể về độc lực của PCV2a/PRRSV-2 và PCV2b/PRRSV-2 [18,19]. Mô hình gây nhiễm đơn lẻ cho thấy sự khác biệt không nhất quán về độc lực giữa các kiểu gen khác nhau. Chủng PCV2d của Trung Quốc có thể gây bệnh nặng hơn so với các chủng PCV2a hoặc PCV2b [10]. Những phát hiện này trái ngược với mô hình gây nhiễm đơn lẻ, trong đó ba kiểu gen PCV2 đều biểu hiện độc lực tương tự trong các nghiên cứu hiện tại và trước đây với các chủng phân lập ở Hàn Quốc và Bắc Mỹ [9,11].

 

PRRSV làm tăng khả năng nhân lên  của PCV2, bất kể kiểu gen PCV2 đồng nhiễm. Sự gia tăng nhân lên của PCV2 bởi tác động của PRRSV có thể liên quan đến các cytokine tiền viêm [20]. Sự tác động có thể không giống nhau vì các chủng PRRSV gây ra các phản ứng tiền viêm với mức độ khác nhau [21]. Sự nhân lên của PCV2 có thể được tăng cường bởi interferon-γ trong điều kiện phòng thí nghiệm [20], và có sự gia tăng ở heo bị nhiễm PRRSV [22]. Ngoài ra, sự nhân lên PCV2 qua trung gian interferon bị giảm nếu có đột biến ở yếu tố đáp ứng kích hoạt interferon PCV2 (ISRE) ở heo bị nhiễm bệnh [23]. Vai trò của ISRE được đánh giá ở heo đồng nhiễm PCV2 và PRRSV. Đột biến ISRE ở PCV2 làm giảm sự nhân lên của virus trong giai đoạn đầu của sự đồng nhiễm, nhưng làm tăng sự nhân lên của virus trong giai đoạn muộn của sự đồng nhiễm [24]. Sự nhân lên PCV2 được tăng cường bởi PRRSV khá phức tạp và cần có các nghiên cứu sâu hơn để làm sáng tỏ các cơ chế của PRRSV làm tăng cường sự nhân lên của PCV2. Tuy nhiên, cơ chế làm tăng độc lực của các chủng PCV2d, so với PCV2a và PCV2b vẫn chưa rõ ràng trong mô hình gây nhiễm kép. Độc lực gia tăng tạm thời có thể liên quan đến 1 a-xít amin lysin (K) có thêm trong protein capsid được mã hóa bởi ORF2 của PCV2d, có độ dài 234 axit amin (aa), so với 233 aa capsid của các chủng PCV2a và b [10]. Hơn nữa, hiện tượng tái tổ hợp, đặc biệt là liên quan đến ORF2, có thể ảnh hưởng đến tính kháng nguyên và độc lực của PCV2 [25, 26]. Do đó, có thể suy đoán rằng PCV2d nhân lên hiệu quả hơn trong các phản ứng tiền viêm do nhiễm PRRSV gây ra do sự khác biệt về gen ở PCV2d và hai kiểu gen PCV2 a và b. Các nghiên cứu sâu hơn là cần thiết để làm sáng tỏ cơ chế PRRSV chống lại PCV2d.

 

Trong mô hình gây nhiễm kép, chủng PCV2d độc lực cao hơn có tải lượng virus trong máu cao hơn và gây ra các tổn thương bạch huyết nghiêm trọng hơn so với các chủng PCV2a và PCV2b ít độc lực hơn. Mức độ PCV2 trong máu tương quan với mức độ nghiêm trọng của các tổn thương bạch huyết. Việc đánh giá các tổn thương mô bạch huyết là rất quan trọng trong việc xác định độc lực của chủng PCV2, vì các tổn thương mô bạch huyết là một trong những tiêu chí của PCVAD. Trong nghiên cứu này, không giống như ở những heo bị gây nhiễm đơn lẻ PCV2, những heo bị gây nhiễm kép PCV2 và PRRSV biểu hiện lâm sàng điển hình của PCVAD. Do đó, PCV2 là tác nhân chủ yếu gây bệnh PCVAD nhưng không đủ để gây ra các biểu hiện lâm sàng đầy đủ của PCVAD. Trong số các tác nhân tiềm năng, PRRSV được coi là yếu tố nguy cơ chính gây ra PCVAD ở heo nhiễm PCV2 [16,17,27,28]. Heo đồng nhiễm PCV2d và PRRSV gây ra các tổn thương mô bạch huyết nghiêm trọng hơn so với heo đồng nhiễm PCV2a và PRRSV hoặc PCV2b và PRRSV. Độc lực cao của PCV2d/PRRSV có ý nghĩa lâm sàng vì PCV2d là kiểu gen chiếm ưu thế nhất hiện đang lưu hành khắp châu Á và Bắc Mỹ. Tuy nhiên, không có sự khác biệt đáng kể nào về ADWG được quan sát thấy ở các nhóm PCV2a/PRRSV, PCV2b/PRRSV và PCV2d/PRRSV. Tác động của các kiểu gen PCV2 trong sự đồng nhiễm đối với ADWG không ghi nhận được có thể là do thời gian quan sát ngắn.

 

Thí nghiệm này nhằm so sánh độc lực giữa ba kiểu gen của PCV2. Do đó, PRRSV đơn thuần được sử dụng làm đồng yếu tố để gây ra biểu hiện đầy đủ của PCVAD. PCV2a và PCV2b không làm tăng tải lượng vi rút PRRSV trong máu hoặc tổn thương phổi ở heo bị nhiễm song song PCV2a và PRRSV-2 hoặc PCV2b và PRRSV-2 [17]. Ngoài ra, không có sự khác biệt đáng kể nào về tải lượng PRRSV-2 trong máu được tìm thấy ở heo bị gây nhiễm đồng thời PCV2a/PRRSV-2, PCV2b/PRRSV-2 hoặc PCV2d/PRRSV. ADWG cũng không bị ảnh hưởng bởi PRRSV trong mô hình gây nhiễm đồng thời [19]. Vì tác dụng của PCV2 đối với PRRSV không được đặt ra trong thí nghiệm này, do đó, nghiên cứu không đưa vào những con heo bị nhiễm đơn PRRSV theo khuyến nghị của Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật của Viện Đại học Quốc gia Seoul, để tránh việc sử dụng heo một cách không cần thiết. Các nghiên cứu bổ sung là cần thiết để xác định ảnh hưởng của PCV2 đối với PRRSV-2 bao gồm thêm nhóm nhiễm PRRSV-2.

 

Cần thận trọng khi diễn giải kết quả vì mỗi kiểu gen PCV2 chỉ sử dụng một chủng trong thí nghiệm này. Heo đồng nhiễm PCV2d và PRRSV-2 có nồng độ PCV2 trong máu cao hơn và tổn thương mô bạch huyết nghiêm trọng hơn so với heo đồng nhiễm các kiểu gen PCV2 khác và PRRSV-2. Hơn nữa, đồng nhiễm PRRSV-2 gây ra PCVAD nghiêm trọng hơn ở heo đồng nhiễm so với PRRSV-1 [19]. Do đó, người chăn nuôi và người hành nghề trong chăn nuôi heo nên giám sát thường xuyên kiểu gen của PCV2 và PRRSV để có thể phát hiện bất kỳ nguy cơ tiềm ẩn nào khi có sự xâm nhập các kiểu gen mới của vi rút vào đàn heo.

 

4. Vật liệu và phương pháp

 

4.1 Vật nuôi

 

Bốn mươi hai con heo khỏe mạnh về mặt lâm sàng, đã được bú sữa non từ những con heo nái chưa được tiêm phòng PCV2 trước đó, được mua lúc 28 ngày tuổi từ một trang trại thương mại không nhiễm PRRSV, Mycoplasma hyopneumoniae, dựa trên xét nghiệm huyết thanh học, lịch sử giết mổ và lâm sàng lâu dài. Trang trại có huyết thanh dương tính với PCV2 nhưng không có biểu hiện PCVAD. Năm heo nái được sử dụng trong thí nghiệm có huyết thanh âm tính với PRRSV (HerdChek PRRS X3 Ab test, IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, ME, USA), PCV2 (INgezim CIRCO IgG, Ingenasa, Madrid, Spain) và M. hyopneumoniae (M. Hyo, xét nghiệm Ab, IDEXX Laboratories Inc). Năm con heo nái đã được xác nhận âm tính với PCV2 (a, b, và d) và PRRSV trong máu và M. hyopneumoniae trong dịch hầu bằng xét nghiệm realtime PCR. Heo nái cũng âm tính với porcine parvovirus (PPV) 1 và 7 qua xét nghiệm máu bằng realtime PCR [29].

 

Những con heo được chọn trong thí nghiệm có huyết thanh âm tính với PRRSV, PCV2 và M. hyopneumoniae được xác định với cùng một kit ELISA thương mại, âm tính với PCV2 (a, b và d), PRRSV, PPV1 và PPV7 trong máu và M. hyopneumoniae trong dịch hầu xét nghiệm bằng realtime PCR.

 

4.2 Bố trí thí nghiệm

 

Heo được phân thành 7 nhóm (6 heo mỗi nhóm) bằng cách sử dụng chức năng tạo số ngẫu nhiên từ Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA) (Bảng 1). Heo được phân ngẫu nhiên vào bảy phòng riêng biệt. Ở ngày 0 sau gây nhiễm (42 ngày tuổi), heo trong các nhóm PCV2a, PCV2b và PCV2d được gây nhiễm qua mũi hoặc 3 mL PCV2a (chủng SNUVR100032, cấy truyền đời thứ 5 trong môi trường tế bào PK15 không nhiễm PCV, dòng tế bào PK15 không nhiễm PCV được được cung cấp bởi WOOGENE B&G Ltd., Seoul, Hàn Quốc), PCV2b (chủng SNUVR202155, cấy truyền đời thứ 5 trong môi trường tế bào PK15 không nhiễm PCV) hoặc PCV2d (chủng SNUVR202003, cấy truyền đời thứ 5 trong môi trường tế bào PK15 không nhiễm PCV), dịch virus chứa 1,2 × 10⁵ 50% liều gây nhiễm tế bào 50% (TCID₅₀/mL), theo từng nhóm tương ứng. Heo trong các nhóm PCV2a/PRRSV-2, PCV2b/PRRSV-2 và PCV2d/PRRSV-2 được gây nhiễm trong mũi một huyễn dịch PCV2 (PCV2a, PCV2b hoặc PCV2d) và PRRSV-2 có cùng thể tích. Dịch virus gây nhiễm gồm 3mL chứa 1,2 × 10⁵ TCID₅₀/mL cho từng kiểu gen PCV2 và 3 mL dịch cấy PRRSV-2 (chủng SNUVR090851) (1,2 × 10⁵ TCID₅₀/mL). Heo bị gây nhiễm PRRSV-2 (chủng SNUVR090851) gây viêm phổi kẽ nghiêm trọng ở phổi [30]. Heo trong nhóm đối chứng âm tính được gây nhiễm trong mũi 6 mL (3 mL/lỗ mũi) dịch nổi môi trường nuôi cấy tế bào không bị nhiễm PCV.

 

Mẫu máu được thu thập từ mỗi con heo tại tĩnh mạch cổ ở 0, 7, 14 và 21 ngày sau gây nhiễm. Heo được gây mê bằng cách tiêm tĩnh mạch natri pentobarbital và sau đó được cho điện giật ở 21 ngày sau gây nhiễm như đã mô tả trước đây [31]. Mẫu mô cơ quan được thu thập từ mỗi con heo khi mổ khám tử. Trước khi nghiên cứu bắt đầu, tất cả các quy trình thử nghiệm đã được phê duyệt bởi Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật Thể chế của Đại học Quốc gia Seoul (SNU-210120-7).

 

4.3 Đánh giá lâm sàng

 

Heo được theo dõi hàng ngày về các dấu hiệu lâm sàng và được chấm điểm hàng tuần bằng hệ thống xếp hạng điểm số từ 0 đến 6 (0 = bình thường; 1 = khó thở nhẹ hoặc thở nhanh hoặc cả hai khi bị stress; 2 = khó thở nhẹ hoặc thở nhanh hoặc cả hai khi nghỉ ngơi; 3 = khó thở vừa phải hoặc thở nhanh hoặc cả hai khi bị stress; 4 = khó thở vừa phải hoặc thở nhanh hoặc cả hai khi nghỉ ngơi; 5 = khó thở nặng hoặc thở nhanh hoặc cả hai khi bị stress; 6 = khó thở nặng hoặc thở nhanh hoặc cả hai khi nghỉ ngơi) [32]. Tất cả những người quan sát tham gia vào các quá trình này đều không biết trước loại vi rút gây nhiễm. Nhiệt độ trực tràng được đo và ghi lại hàng ngày trong 14 ngày sau khi gây nhiễm PCV2 và PRRSV đồng thời và được thực hiện bởi cùng một nhân viên.

 

4.4 Năng suất tăng trưởng

 

Trọng lượng sống của mỗi con heo được cân ở 42 (0 ngày sau gây nhiễm) và 63 (21 ngày sau gây nhiễm) ngày tuổi. Tăng trọng bình quân hàng ngày (ADWG; gam/heo/ngày) được phân tích trong khoảng thời gian từ 42 đến 63 ngày tuổi. ADWG trong các giai đoạn sản xuất khác nhau được tính bằng chênh lệch giữa trọng lượng ban đầu và trọng lượng cuối cùng chia cho số ngày của giai đoạn.

 

4.5 Định lượng DNA của PCV2 trong máu

 

Bộ kit thương mại (QIAamp DNA mini kit, QIAGEN, Valencia, CA, USA) được sử dụng để trích xuất DNA PCV2 từ các mẫu huyết thanh. Số bản sao DNA của PCV2a, PCV2b và PCV2d được định lượng bằng realtime PCR [33,34].

 

4.6 Định lượng cDNA của PRRSV trong máu

 

Bộ kit thương mại (QIAamp virus RNA mini kit, QIAGEN) được sử dụng để chiết xuất RNA của PRRSV-2 từ các mẫu huyết thanh, như đã mô tả trước đây [29]. Real-time PCR được thực hiện để định lượng bản sao cDNA bộ gen PRRSV-2 [35].

 

4.7 Huyết thanh học

 

Các mẫu huyết thanh được kiểm tra kháng thể chống lại PCV2 (INgezim CIRCO IgG, Ingenasa, Madrid, Tây Ban Nha) và PRRSV (xét nghiệm HerdChek PRRS X3 Ab, IDEXX Laboratories Inc.). Các mẫu được coi là dương tính với kháng thể PCV2 nếu mật độ quang học (OD) lớn hơn 0,3, và lớn hơn 0,4 đối với kháng thể PRRSV theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

 

4.8 Mô bệnh học

 

Để phân tích những thay đổi mô bệnh học ở các hạch bạch huyết bẹn nông, ba mẫu cắt vi thể của hạch bạch huyết được mã hoá và kiểm tra [36]. Hạch bạch huyết được đánh giá sự suy giảm mô bạch huyết và viêm, và cho điểm từ 0 đến 5 (0 = bình thường; 1 = suy giảm mô bạch huyết nhẹ; 2 = suy giảm mô bạch huyết nhẹ đến trung bình và thay thế mô bào; 3 = suy giảm mô bạch huyết tràn lan vừa và thay thế mô bào; 4 = suy giảm mô bạch huyết trung bình đến nặng và thay thế mô bào; 5 = suy giảm mô bạch huyết nghiêm trọng và thay thế mô bào).

 

4.9 Hoá mô miễn dịch

 

Xét nghiệm hóa mô miễn dịch (IHC) và phân tích hình thái của IHC được thực hiện như mô tả trước đây [37]. Tín hiệu dương tính được định lượng bằng chương trình NIH Image J 1.45s (//imagej.nih.gov/ij/download.html, truy cập vào ngày 12 tháng 7 năm 2021). Đối với mỗi mẫu mô hạch bạch huyết, 10 hiển vi trường được quan sát ngẫu nhiên và số lượng tế bào dương tính trên một đơn vị diện tích (0,25 mm2) được đếm và tính toán giá trị trung bình [37].

 

4.10 Phân tích thống kê

 

Trước khi phân tích thống kê, dữ liệu realtime PCR được chuyển đổi log để giảm phương sai và độ lệch dương. Dữ liệu được kiểm tra theo phân phối bình thường bằng cách sử dụng phép tính Shapiro–Wilk. Phân tích phương sai một chiều (ANOVA) được sử dụng để kiểm tra sự khác biệt thống kê giữa bảy nhóm cho từng thời điểm. Nếu kết quả kiểm tra ANOVA một chiều cho thấy có ý nghĩa thống kê, tiến hành so sánh theo cặp với hiệu chỉnh Tukey. Nếu giả định chuẩn không được đáp ứng, trắc nghiệm Kruskal–Wallis sẽ được thực hiện. Nếu kết quả từ trắc nghiệm Kruskal–Wallis cho thấy có ý nghĩa thống kê, trắc nghiệm Mann–Whitney với sự hiệu chỉnh Tukey được thực hiện để so sánh sự khác biệt giữa các nhóm. Tương quan Spearman (các biến số không phân bố chuẩn) được áp dụng để xác định mối quan hệ giữa nồng độ PCV2 trong máu và mức độ nghiêm trọng của các tổn thương bạch huyết. Kết quả được xem là có khác biệt thống kê khi giá trị của p <0,05.