Reutericin là bacteriocin nhóm II dạng vòng, bền nhiệt có nguồn gốc từ Lactobacillus reuteri, được ứng dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm. Các chủng sinh bacteriocin có nguồn gốc tự nhiên biểu hiện peptide này ở mức độ thấp, do đó có nhiều chiến lược phát triển nhằm tăng sự biểu hiện bacteriocin mục tiêu thông qua kỹ thuật tái tổ hợp gen. Trong nhiều chủng chủ biểu hiện protein tái tổ hợp, nấm men Saccharomyces cerevisiae được biết đến như một chủng chủ có giá trị dinh dưỡng cao, được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm cũng như probiotic. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày một cách tiếp cận mới bằng chiến lược biểu hiện Reutericin trên bề mặt tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae nhằm hướng tới phát triển tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae cho chế phẩm probiotic trong chăn nuôi gia súc và nuôi trồng thuỷ hải sản. Gen mã hoá cho Reutericin được dung hợp với với gen α-agglutinin, mã hoá cho α-Agglutinin trên bề mặt tế bào nấm men. Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae W303 tái tổ hợp mang dung hợp gen reutericin- α-agglutinin cho thấy khả năng sinh trưởng trên môi trường khuyết dưỡng tryptophan. Kết quả quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang cũng cho thấy Reutericin đã được biểu hiện trên bề mặt tế bào nấm men. Như vậy, các kết quả thực nghiệm chứng tỏ chúng tôi đã tạo dòng thành công dòng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae W303: reutericin mang và biểu hiện Reutericin trên bề mặt tế bào.

MỞ ĐẦU

Bacteriocin là những peptide hay protein kháng khuẩn, được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram âm hoặc Gram dương [3]. Reutericin là bacteriocin nhóm IIc, được sinh tổng hợp bởi Lactobacillus reuteri LA6, có trọng lượng phân tử 5,6kDa, bền nhiệt, tác động vào màng tế bào của tế bào vi khuẩn mục tiêu như  Lactobacillus bulgaricus. Bacteriocin được sản xuất bởi các vi khuẩn lactic (LAB), được công nhận an toàn trong bảo quản thực phẩm [5]. Biểu hiện hàm lượng thấp là nhược điểm của các chủng sinh bacteriocin tự nhiên, do đó nhiều nghiên cứu đã hướng đến biểu hiện bacteriocin tái tổ hợp trong các hệ thống tế bào chủ khác nhau như Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, LAB [4, 7, 8].

Nấm men Saccharomyces cerevisiae được ứng dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm, nước uống và được công nhận là an toàn GRAS (generally regarded as safe); nhiều nghiên cứu về sản xuất bacteriocin tái tổ hợp từ Saccharomyces cerevisiae đã thành công như Pediocin [10], Enterocin L50 [1]. Song song đó, những thành công về biểu hiện protein tái tổ hợp trên bề mặt tế bào nấm men bằng dung hợp gen mục tiêu với gen mã hóa cho các protein trên màng tế bào đã mở ra một hướng phát triển mới cho công nghệ protein tái tổ hợp. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng protein như FLO1, Cwps và a-/α-agglutinin để dung hợp, biểu hiện protein mục tiêu lên bề mặt tế bào nấm men [11]. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành thiết kế tạo dòng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae tái tổ hợp dung hợp gen bacteriocin với α-agglutinin nhằm biểu hiện Reutericin trên bề mặt tế bào nấm men.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chủng vi sinh vật và plasmid

Chủng Escherichia coli DH5α [F^–, θ80lacZ∆M15, recA1, endA1, hsdR17 (r_k^–, m_k⁺), phoA, supE44, λ^–, thi-1, gyrA96, relA1] (Takara, Nhật) dùng làm tế bào chủ để nhân bản plasmid. Chủng Saccharomyces cerevisiae W303 [MATa/MATα {leu2-3,112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15}] dùng để biểu hiện protein dung hợp lên bề mặt.

Vector pICAS-1 (PTN. Công nghệ sinh học phân tử, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG-HCM) được thiết kế để làm vector tái tổ hợp mang gen reutericin, có kích thước 6457bp, mang gen kháng ampicilin giúp sàng lọc dòng tế bào vi khuẩn mang vector, chứa promoter GADPH kiểm soát biểu hiện bởi glucose, trình tự tiết SSS (secrection signal sequence) giúp protein chuyển vị qua màng để gắn lên vách tế bào.

Gen mã hoá cho Reutericin được thiết kế dựa trên trình tự gen tại ngân hàng peptide kháng khuẩn (http://bactibase.pfba-lab-tun.org/BAC168), mã số BAC 168 .

Cấu trúc vector tái tổ hợp pICAS-reutericin

Vector pICAS-1 được tách chiết bằng phương pháp SDS (Sodium dodecyl sulfat) kiềm (Birnboim & Doly, 1979) [2] từ dòng tế bào Escherichia coli DH5α/pICAS-1 và được cắt mở vòng bằng hai enzyme cắt giới hạn BglII và XhoI. Song theo đó, gen reutericin được đặt tổng hợp được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen BglII-Rt (GGA AGA TCT CCA TTT ATT GGA TTG CTG ATC) và XhoI-Rt (CCG CTC GAG CGG AGC AGC AGT AGC ACC CAA AG). Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra.

Sản phẩm cắt được tinh chế qua cột EZ-10 (Biobasic, Cannada) và  nối bằng enzyme T4 ligase, sau đó được hóa biến nạp vào tế bào Escherichia coli DH5α và được sàng lọc trên môi trường LB agar (trypton 1%, NaCl 1%, cao nấm men 0.5%) có chứa kháng sinh ampicilin nồng độ 100 µg/ml. Thể biến nạp được kiểm tra bằng phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi BglII-Rt và XhoI-Rt. Bên cạnh đó, các khuẩn lạc còn được tách chiết plasmid bằng phương pháp SDS kiềm, sau đó kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng cắt với enzyme BglII và XhoI và kiểm tra sự hiện diện của trình tự gen trên palsmid bằng PCR với cặp mồi BglII-Rt và XhoI-Rt.

Chương trình PCR thu nhận và kiểm tra gen reutericin: 1 chu kỳ: 95^oC-5 phút; 30 chu kỳ: 94^oC-45 giây, 55^oC-30giây, 72^oC-30 giây; 1 chu kỳ 72^oC-10 phút. Sản phẩm PCR sau đó được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.

Tạo dòng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae W303 mang vector tái tổ hợp pICAS-reutericin

Vector pICAS-reutericin được biến nạp vào tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae W303 bằng phương pháp lithium acetate cải biên (Gietz and Schiestl, 2007) [6]. Sản phẩm biến nạp được sàng lọc trên môi trường khuyết dưỡng tryptophan (SD^– : leucin 30mg, Histidin 20mg, Adenin 20mg, Uracin 20mg, Yeast nitrogen base 6,7g, Glucose 20g, nước cất đủ 1lit). Các khuẩn lạc mọc được trên môi trường khuyết dưỡng tiến hành tách chiết genome (Rose et al., 1990) [9] và PCR kiểm tra với cặp mồi BglII-Rt và XhoI-Rt đặc hiệu cho gen reutericin.

Vì Reutericin được thiết kế gắn them đuôi dung hợp histinde cho mục đích nhận diện protein nên trên bề mặt tế bào nên, tế bào Saccharomyces cerevisiae W303 mang vector tái tổ hợp pICAS-reutericin (Saccharomyces cerevisiae W303:reutericin) được kiểm tra sự biểu hiện Reutericin trên bề mặt tế bào bằng nhuộm miễn dịch huỳnh quang (Tang et al., 2008) [11] với kháng thể kháng poly-Histidine (GE Healthcare, Việt Nam) (1:1000) trong 1 giờ ở 25oC, sau đó ủ với kháng thể bậc hai có gắn chất phát huỳnh quang Alexa 488 (Invitrogen, Nhật Bản) (1:400) trong 2 giờ ở 25oC. Xem kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang Olympus BX41 (Olympus, Hoa Kỳ).

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Tối ưu và thiết kế dung hợp gen mã hoá Reutericin trong biểu hiện protein trên bề mặt tế bào nấm men

Trong chiến lược biểu hiện và gắn Reutericin trên bề mặt tế bào nấm men, peptide này được dung hợp với đoạn peptide đầu C của α-agglutinin, một protein trên bề mặt tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae, và peptide tín hiệu neo GPI (glycosyl-phosphatidyl – inositol) giúp phân tử protein cố định trên màng (hình 1a). Sau khi được sinh tổng hợp trên lưới nội chất nhám, toàn bộ dung hợp protein này được điều khiển tiết ra bề mặt tế bào nấm nhờ hoạt động của peptide tín hiệu tiết (SSS) (hình 1b).

Hình 1. Chiến lược biểu hiện trên bề mặt tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae   (a): Cấu trúc gen dung hợp protein; (b) Con đường tiết protein ra ngoài màng tế bào nấm men

Hình 2. Tối ưu gen biểu hiện Reutericin trên bề mặt tế bào nấm men S. cerevisiae

Reutericin là peptide có nguồn gốc từ vi khuẩn Lactobacillus reuteri, do vậy, khi phân tích độ tương thích với bảng mã di truyền của nấm men Saccharomyces cerevisiae chúng tôi nhận thấy 13/57 codon có độ tương thích nhỏ hơn 50% và 19/57 codon có độ tương thích nhỏ hơn 70% (hình 2a). Kết quả phân tích này đưa đến nhận định là rất có thể gen mã hoá cho reutericin từ Lactobacillus reuteri khó được nhận diện và biẻu hiện trong nấm men Saccaromyces cerevisiae.

Nhằm tối ưu gen mã hoá cho peptide này trong hệ thống tế bào chủ nấm men, chúng tôi sử dụng phần mềm thiết kế gen Snap Gene 2.6.2 với bộ thông số về codon mã hoá của nấm men S. cerevisiae để chuyển đổi các codon khó nhận diện và các codon không dịch mã trên gen reutericin của Lactobacillus reuteri thành các codon dịch mã cho cùng acid amin của nấm men. Kết quả phân tích trình tự gen trên hình 2b cho thấy, sau khi tối ưu của gen mã hoá cho Reutericin có độ tương thích 100% với bảng mã
di truyền của hệ thống tế bào chủ nấm men.

Cấu trúc vector tái tổ hợp pICAS-reutericin biểu hiện trên bề mặt tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae

Vector pICAS-1 có kích thước 6457bp, có dùng trình tự nhận biết của các enzyme cắt giới hạn trong vùng MCS (multiple cloning site) (hình 3a) và được thu nhận (hình 3b, giếng 4). Song song theo đó, vector pICAS-1 được cắt bằng hai enzyme cắt giới hạn BglII và XhoI cho một vạch có kích thước khoảng 6445bp trên bản điện di (hình 3b, giếng 5) và đoạn oligonucletotide có chiều dài 12bp (không phát hiện trên bản điện di), kích thước này gần bằng kích thước của vector pICAS-1 sau khi mở vòng (6457bp). Theo đó, gen reutericin được PCR và cắt bằng hai enzyme BglII và XhoI, cũng cho một vạch có kích thước khoảng 200bp như đã thiết kế (hình 3b, giếng 3).

Gen reutericin sau khi cắt được nối vào vector pICAS-1, sản phẩm nối được biến nạp vào Escherichia coli DH5α, các khuẩn lạc mọc được trên môi trường LB agar ampicilin tiến hành kiểm tra bằng PCR. Kết quả kiểm tra cho thấy một số khuẩn lạc E. coli mang gen mục tiêu (hình 3c, giếng 4, giếng 6, giếng 8). Các khuẩn lạc này tiếp tục được hoạt hóa, tách chiết plasmid và PCR với cặp mồi BglII-Rt và XhoI-Rt đặc hiệu cho gen reutericin. Kết quả điện di cho thấy chúng tôi đã thu được plasmid tái tổ hợp mang gen reutericin (hình 3d, giếng 4-6). Gen reutericin trên các plasmid tái tổ hợp được giải trình tự và kiểm tra sự đồng khung dịch mã.

Hình 3. Cấu trúc vector tái tổ hợp pICAS-reutericin (a): Cấu trúc vector pICAS-1; (b): Thu nhận gen reutericin và plasmid pICAS-1. 1. Thang DNA 1kbp; 2. Chứng âm phản ứng PCR; 3. Sản phẩm PCR gen sau khi cắt; 4. Plasmid tách bằng  phương pháp SDS kiềm; 5. Plasmid sau khi cắt; (c): PCR khuẩn lạc E.coli DH5α/pICAS-reutericin. 1. Thang DNA 1kbp; 2. Chứng dương phản ứng PCR; 3. Chứng âm phản ứng PCR; 4-8. Sản phẩm PCR khuẩn lạc E.coli DH5α khác nhau; (d): PCR plasmid tái tổ hợp E.coli DH5α/pICAS-reutericin. 1. Thang DNA 1kbp; 2. Chứng dương phản ứng PCR; 3. Chứng âm phản ứng PCR; 4-6. Sản phẩm PCR plasmid  khác nhau.

Tạo dòng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae W303 mang vector tái tổ hợp pICAS-reutericin.

Vector tái tổ hợp pICAS-reutericin được biến nạp vào nấm men Saccharomyces cerevisiae W303. Các dòng nấm men mang vector tái tổ hợp mang dung hợp gen  pICAS-reutericin được chọn lọc dựa trên sự phát triển của chúng trên môi trường SD khuyết dưỡng tryptophan (SD^–) (hình 4a). Saccharomyces cerevisiae W303 đột biến gen tổng hợp tryptophan, không phát triển được trên môi trường SD^–. Tuy nhiên, khi chủng chủ chủ nấm men tiếp nhận dung hợp gen cấu trúc vector pICAS-reutericin sẽ trở nên có khả năng mã hóa tryptophan và phát triển trên môi trường SD^– (hình 4b). Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen reutericin trên bộ gen của nấm men tái tổ hợp cũng cho thấy các chủng nấm men này mang dung hợp gen mục tiêu (hình 4c, giếng 5). Bên cạnh đó, khi nhuộm miễn dịch huỳnh quang với kháng thể kháng poly-Histidin trên màng tế bào Saccharomyces cerevisiae W303: reutericin cho tính hiệu huỳnh quang trên màng ở pha tối (chiếu ánh sáng huỳnh quang bước sóng 488 nm) trong khi dòng tế bào đối chứng Saccharomyces cerevisiae W303 không cho tính hiệu này (hình 4d). Kết quả này đã khẳng định Reutericin có thể biểu hiện được trên bề mặt tế bào nấm men.

Hình 4. Sàng lọc dòng tế bào nấm men mang vector tái tổ hợp pICAS-reutericin

(a): Nguyên tắc sàng lọc trên môi trường khuyết dưỡng; (b): Kết quả biến nạp vector pICAS-reutericin vào tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae W303; (c): Kiểm tra sự hiện diện của dung hợp gen trong tế bào nấm men. 1. Thang DNA 100bp; 2. Dung hợp gen; 3. Kết quả phản ứng PCR với khuôn là DNA bộ gen của nấm men; 4-9. Kết quả phản ứng PCR với khuôn là DNA bộ gen từ các khuẩn lạc nấm men tái tổ hợp sàng lọc được trên môi trường SD^–; (d): Kiểm tra biểu hiện gen reutericin trên bề mặt tế bào bằng nhuộm miễn dịch huỳnh quang với kháng thể kháng poly-Histidin. Pha sáng là ánh sáng trắng và pha tối ánh sáng huỳnh quang bước sóng 488 nm.

KẾT LUẬN

Chúng tôi đã cấu trúc thành công vector tái tổ hợp pICAS-reutericin nhằm biểu hiện Reutericin dung hợp 3’α-agglutinin trên bề mặt tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae. Đồng thời bước đầu sàng lọc được dòng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae W303 mang vector pICAS-reutericin. Dòng nấm men tái tổ hợp này là nguyên liệu cơ bản trong các nghiên cứu sâu hơn về con đường biểu hiện tiết Reutericin trên bề mặt tế bào.

Nguyễn Hiếu Nghĩa, Nguyễn Trí Nhân, Đặng Thị Phương Thảo

Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG-HCM