TÓM TẮT

 

Nghiên cứu được thực hiện nhằm đánh giá khả năng ức chế virus Dịch tả lợn châu Phi (DTLCP) của 09 đơn chất có nguồn gốc thảo dược gồm: Apigenin, Genkwanin, Allicin, Betulin, Quercetin, Saponin, Tanshinon IIa, Maslinic acid và Catechin. Khi thử nghiệm khả năng gây độc tế bào trên đại thực bào phế nang lợn, Saponin gây độc tế bào ở nồng độ 150 µM, Allicin, Quercetin và Catechin gây độc tế bào ở nồng độ 200 µM, các chất còn lại không gây độc tế bào ở nồng độ 200 µM. Kết quả thử nghiệm khả năng ức chế virus DTLCP của các đơn chất cho thấy chỉ có Apigenin thể hiện khả năng ức chế virus DTLCP rõ nhất. Sau 48 giờ tác dụng, Apigenin làm giảm hiệu giá của virus DTLCP xuống 1,67 đơn vị HAD₅₀, từ 10^7,47 xuống 10^5,80.

 

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

 

Dịch tả lợn Châu Phi (African Swine Fever) (DTLCP) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do virus thuộc họ Asfarviridae, giống Asfivirus gây ra. Bệnh bắt nguồn từ châu Phi, được ghi nhận tại Đông Âu và Nga trước khi xuất hiện tại Trung Quốc lần đầu vào hồi tháng 08/2018. Sau đó bệnh đã được xác nhận tại Việt Nam vào 19∕02∕2019 đã gây ra những thiệt hại nặng nề đối với ngành chăn nuôi lợn Việt Nam cho đến nay. Hiện tại bệnh Dịch tả lợn châu Phi chưa có vắc xin thương mại và cũng không có thuốc điều trị đặc hiệu. Trong bối cảnh Dịch tả lợn châu Phi đã, đang và sẽ tiếp tục diễn ra, để lại thiệt hại không hề nhỏ cho ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi lợn nói riêng, việc tìm ra được những chất có khả năng ức chế virus gây bệnh là điều cấp thiết. Nghiên cứu này khảo sát và tìm hướng ứng dụng của các hoạt chất có nguồn gốc từ tự nhiên, cụ thể là từ các dược liệu sẵn có của y học dân gian, ứng dụng vào công tác phòng chống bệnh. Những đơn chất được thử nghiệm gồm có: Apigenin, Genkwanin, Allicin, Betulin, Quercetin, Saponin, Tanshinon IIa, Maslinic acid và Catechin.

 

Apigenin (4’,5,7-trihydroxyflavon) là một flavonoid tự nhiên, thuộc nhóm flavon được tìm thấy trong nhiều loài thực vật, nhưng rau mùi tây, cần tây và cúc hoa là những nguồn phổ biến nhất. Apigenin có thể làm giảm đến 99,99% virus DTLCP sau khi ủ trong 1 giờ. Những tế bào nhiễm virus DTLCP nếu được bổ sung Apigenin sẽ không biểu hiện bệnh tích tế bào (Hakobyan & cs, 2016).Genkwanin (4’,5-Dihyroxy-7-methoxyflavone) là một monomethoxylflavone, được coi là một dẫn xuất của Apigenin (thay thế nhóm hydroxyl bằng methyl). Genkwanin có thể tìm thấy ở là cây trầm hương. Thêm vào đó Genkwanin còn có khả năng ức chế sự xâm nhập của virus DTLCP và có thể làm giảm hàm lượng virus DTLCP chủng Ba71V từ 6,5 xuống 4,75 log TCID₅₀/ml (Hakobyan et al., 2019).Allicin là thành phần quan trọng nhất về mặt tác dụng sinh học có ở tinh dầu tỏi. Nó là một hợp chất chứa S – Alkyl cystein sulfoxid, kết tinh không màu, tan trong nước, hầu như không có mùi. Hoạt chất của tỏi có hiệu quả tiêu diệt virus (Weber và cộng sự, 1992), ví dụ như virus gây bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (Shojai & cs, 2016).Betulin: Trong số các hoạt chất tìm thấy nhiều trong xuân hoa, betulin là thành phần thường được biết đến là cho tác dụng tốt trên virus (John, 2018; Amiri và cộng sự, 2019).Quercetin là một flavonoid thực vật có hoạt tính chống oxy hóa mạnh. Ở Việt Nam và một số nước Châu Á, Quercetin được thu nhận chủ yếu từ rutin trong nụ hoa khô của cây Hòe. Quercetin có khả năng ức chế quá trình xâm nhập của virus cúm A (Wu et al., 2016).Saponin còn gọi là saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật. Saponin có trong nhiều loài thực vật, cả thực vật hoang dại lẫn thực vật gieo trồng. Saponin có khả năng kháng virus cúm A và virus viêm gan C (Lee et al., 2012; Pu et al., 2015).Tanshinon IIa là một chất bột màu đỏ, được sử dụng để định tính và định lượng đan sâm, một loại thảo dược có nhiều công dụng theo y học cổ truyền. Muối Natri của Tanshinone IIa có khả năng kháng virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (Munagala et al., 2012).Maslinic acid là một hoạt chất có thể được chiết từ lá cây Gối hạc. Hợp chất acid maslinic (2α,3β-dihydroxy-olean-12-en-28-oic acid; công thức phân tử C30H48O4) được phân lập và có tác dụng ức chế mạnh pepsin và protease HIV-1 với giá trị IC50 tương ứng là 3,2 mM và 4,5 µmol (Nguyễn Văn Dũng và cộng sự, 2015).Catechin là flavan-3-ol, một loại phenol tự nhiên và chất chống oxy hóa. Nó là một chất chuyển hóa thứ cấp thực vật. Nó thuộc nhóm flavan-3-ols, một phần của họ hóa học flavonoid. Catechin được chiết xuất chủ yếu từ chè xanh. Catechin được chứng minh là có khả năng ức chế virus cúm A trong khi epigallocatechin gallate có khả năng ức chế sự xâm nhiễm của virus chikungunya (Song et al., 2005; Weber et al, 2015).

 

2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

 

2.1. Vật liệu

 

2.1.1. Chuẩn bị tế bào và virus

 

Nghiên cứu sử dụng tế bào đại thực bào phế nang phổi của lợn (Porcine Alveolar Macrophage – PAM) và chủng virus DTLCP VNUA.ASF.01 có hiệu giá > 10⁶HAD₅₀/ml. Quy trình nuôi cấy được thực hiện bởi phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

 

2.1.2. Đơn chất thử nghiệm

 

Các đơn chất Apigenin, Genkwanin, Allicin, Betulin, Quercetin, Saponin, Tanshinon IIa, Maslinic acid và Catechin là những hoạt chất tinh khiết, được mua từ hãng Sigma (Đức).

 

2.1.3. Hóa chất và dụng cụ

 

Hóa chất: Môi trường thu – nuôi cấy tế PAM và phân lập virus DTLCP: RPMI, Huyết thanh bào thai bò (FBS), Hồng cầu 2%, PBS 1x (Phosphate Buffer saline), kháng nấm, kháng sinh Gentamicin, nước cất hai lần, DMSO (Dimethyl sulfoxide).

 

Dụng cụ và mẫu vật: Đĩa nuôi cấy tế bào 48 giếng; ống falcol 15ml, 50ml của hãng Corning; Eppendorf 1,5ml; Pipette và đầu tip tương ứng 1000µl, 200µl, 20µl, 5ml, 10ml; giá đựng; ống giữ tế bào. Phễu, ống dẫn, kéo, panh, kẹp, dao, khay, chai thủy tinh đã hấp sấy tiệt trùng, cồn 700, màng lọc tiệt trùng 0,45µm.

 

2.2. Nội dung nghiên cứu

 

  Xác định khả năng gây độc tế bào của các đơn chất có nguồn gốc thảo dược

     

Xác định khả năng ức chế virus DTLCP của các đơn chất có nguồn gốc thảo dược

 

2.3. Phương pháp nghiên cứu

 

2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm

 

Nghiên cứu đánh giá được chia thành 2 nhóm, nhóm thí nghiệm bao gồm các đơn chất thử nghiệm và nhóm đối chứng không sử dụng đơn chất. Các đơn chất được hòa tan hoàn toàn bằng dung môi DMSO sau đó pha loãng đến nồng độ thử nghiệm trong dung dịch PBS 1X trung tính sao cho hàm lượng DMSO chỉ chiếm 1% trong nồng độ tác dụng cuối cùng.

 

Nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế virus DTLCP của các đơn chất lựa chọn dựa trên mức độ giảm hiệu giá virus so với đối chứng ở điều kiện thử nghiệm 37⁰C và 03 khoảng thời gian tác dụng 16 giờ, 24 giờ và 48 giờ, thử nghiệm được lặp 03 lần.

 

2.3.2. Phương pháp đánh giá khả năng gây độc tế bào

     

Tế bào PAM được phục hồi và hoàn nguyên trong môi trường RPMI, bổ sung 10%FBS. Nuôi cấy tế bào trên đĩa 48 giếng trong tủ ấm 37^oC bổ sung 5% CO2 trong 16 đến 24 giờ trước khi sử dụng. Pha loãng đơn chất đến các nồng độ lần lượt là 25 μM, 50 μM, 75μM, 100μM, 150μM và 200μM để đánh giá khả năng gây độc tế bào. Ủ hỗn hợp đơn chất ở các nồng độ lên tế bào PAM trong 1 giờ ở 37⁰C và 5% CO₂. Sau 1 giờ, bổ sung môi trường nuôi cấy có hồng cầu lợn, hàng ngày quan sát dưới kính hiển vi soi ngược để kiểm tra khả năng sống sót của tế bào.

 

2.3.3. Phương pháp đánh giá ức chế virus Dịch tả lợn châu Phi

 

Ủ đơn chất ở nồng độ thử nghiệm với virus DTLCP theo tỉ lệ 1:1 ở điều kiện nhiệt độ và thời gian theo thiết kế thí nghiệm. Đối chứng dương được tiến hành đồng thời trong cùng điều kiện bao gồm RPMI 1640 và virus DTLCP theo tỉ lệ 1:1. Sau thời gian tác dụng, nghiên cứu tiến hành hiệu giá hỗn hợp virus và đơn chất trên môi trường tế bào PAM đã chuẩn bị 16 đến 24 giờ. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế virus DTLCP của đơn chất được tính bằng độ giảm hiệu giá virus ở các nồng độ thử nghiệm so với đối chứng dương.

 

2.3.4. Phương pháp xác định hiệu giá HAD₅₀/ml

 

Virus được pha loãng theo cơ số 10 liên tiếp 7 lần trong môi trường nuôi cấy tế bào RPMI có bổ sung 10% FBS. Mỗi nồng độ pha loãng được được gây nhiễm lặp lại 3 giếng tế bào PAM trên đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng được chuẩn bị trước đó (mật độ 2 × 10⁵ tế bào/ giếng). Tế bào sau gây nhiễm virus được nuôi cấy trong điều kiện 37⁰C và 5% CO2 trong tối thiểu 5 ngày. Hiệu giá virus được xác định qua giá trị HAD₅₀/ml (gây ngưng kết hồng cầu trên 50% tế bào) sau ít nhất 5 ngày gây nhiễm, giá trị HAD₅₀/ml được tính theo công thức Reed & Muench.

 

2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu

 

Các số liệu thu thập được tính toán và xử lý bằng phần mềm Excel 2016.

 

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

 

3.1. Kết quả kiểm tra khả năng gây độc tế bào của các đơn chất có nguồn gốc thảo dược

           

Trước khi thử khả năng ức chế virus DTLCP của các đơn chất, chúng tôi cần tìm ra liều gây độc tế bào nuôi cấy. Để đảm bảo lượng đơn chất thử nghiệm dưới ngưỡng gây độc tế bào, tránh sai sót trong quá trình so sánh giữa nhóm đối chứng và nhóm thí nghiệm. Kết quả thử nghiệm khả năng gây độc tế bào PAM của các đơn chất được thể hiện ở bảng 3.1.

 

Bảng 3.1. Kết quả thử độc trên tế bào PAM của các đơn chất

Nồng độ (μM)	Sự xuất hiện bệnh tích tế bào
	Api genin	Gen kwanin	Allicin	Betulin	Quer cetin	Saponin	Tashi nonIIa	Maslinic acid	Catechin	Đối chứng
25	–	–	–	–	–	–	–	–	–	–
50	–	–	–	–	–	–	–	–	–	–
75	–	–	–	–	–	–	–	–	–	–
100	–	–	–	–	–	–	–	–	–	–
150	–	–	–	–	–	+	–	–	–	–
200	–	–	+	–	+	+	–	–	–	–

Ghi chú: +: Có gây độc tế bào; -: Không gây độc tế bào

 

Kết quả bảng 3.1 cho thấy có 6/9 chất không gây độc tế bào ở mức nồng độ 200 μM là Apigenin, Genkwanin, Betulin, Tashinon IIa, Maslinic acid và Catechin. Những chất gây độc tế bào ở mức nồng độ 200 μM là Allicin và Quercetin. Riêng Saponin gây độc tế bào ở mức nồng độ 150 μM. Kết quả này được sử dụng làm cơ sở xác định ngưỡng nồng độ của đơn chất trong thử nghiệm ức chế virus DTLCP.

 

3.2. Kết quả kiểm tra khả năng ức chế virus Dịch tả lợn châu Phi của các đơn chất có nguồn gốc thảo dược

 

Kết quả xác định khả năng ức chế virus DTLCP của các đơn chất sau thời gian tác dụng được trình bày ở Bảng 3.2. Số lượng ngưng kết hoa hồng được đánh giá định tính trên vi trường, lượng Rosetta có sự khác biệt giữa các nhóm thí nghiệm với thời gian ủ virus khác nhau.

 

Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra khả năng ức chế virus Dịch tả lợn châu Phi của các đơn chất

STT	Đơn chất	Nồng độ thử nghiệm (µM)	Thời gian thử nghiệm
			16 giờ	24 giờ	48 giờ
1	Apigenin	40	++++	++	+
		20	++++	+++	++
		10	++++	+++	+++
2	Genkwanin	200	++++	++++	+++
		100	++++	++++	+++
		50	++++	++++	++++
3	Allicin	200	++++	++++	+++
		100	++++	++++	++++
		50	++++	++++	++++
4	Betulin	200	++++	+++	+++
		100	++++	++++	++++
		50	++++	++++	++++
5	Quercetin	200	++++	+++	+++
		100	++++	++++	++++
		50	++++	++++	++++
6	Saponin	100	++++	++++	+++
		50	++++	++++	++++
		10	++++	++++	++++
7	Tanshinon IIa	200	++++	++++	++++
		100	++++	++++	++++
		50	++++	++++	++++
8	Maslinic acid	100	++++	++++	++++
		50	++++	++++	++++
		10	++++	++++	++++
9	Catechin	200	++++	++++	+++
		100	++++	++++	++++
		50	++++	++++	++++

Ghi chú: +, ++, +++, ++++: Số lượng Rosetta tăng dần trên vi trường

           

Kết quả bảng 3.2 cho thấy, trong các đơn chất được thử nghiệm, sau thời gian ủ 48 giờ chỉ có nhóm thí nghiệm với Apigenin thể hiện khả năng ức chế virus DTLCP mạnh. Những đơn chất khác như Genkwanin, Allicin, Betulin, Quercetin, Saponin, Catechin có khả năng ức chế virus DTLCP không rõ ràng. Còn các đơn chất Tanshinon IIa và Maslinic acid không ức chế virus DTLCP, thể hiện ở lượng Rosetta không thay đổi. Trong số những đơn chất được thử nghiệm, chỉ có Apigenin và Genkwanin đã từng được nghiên cứu về khả năng ức chế virus DTLCP. Theo Hakobyan và cộng sự (2016) thì Apigenin có khả năng ức chế đến 99% virus DTLCP, hàm lượng virus giảm từ 5,5 log TCID₅₀/ml (nhóm đối chứng) xuống còn 2,2 log TCID₅₀/ml (nhóm thí nghiệm với 50µM Apigenin). Genkwanin (40 µM) cũng làm giảm lượng virus DTLCP từ 6,5 xuống 4,75 log TCID₅₀/ml (Hakobyan và cộng sự, 2019). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi có sự khác biệt, theo chúng tôi nguyên nhân do chủng virus được thử nghiệm kháng nhau và hàm lượng virus được sử dụng trong xét nghiệm là khác nhau.

 

3.3. Đánh giá khả năng ức chế virus Dịch tả lợn châu Phi của Apigenin qua chỉ số HAD₅₀

           

Từ kết quả đánh giá định tính khả năng ức chế virus DTLCP của các đơn chất, chúng tôi nhận thấy Apigenin có khả năng ức chế virus DTLCP ở mức cao. Chúng tôi xác định khả năng ức chế virus DTLCP của Apigenin dựa vào chỉ số HAD₅₀. Kết quả thể hiện ở bảng 3.3.

 

Bảng 3.3. Kết quả đánh giá khả năng ức chế virus Dịch tả lợn châu Phi của Apigenin

Nồng độ thử nghiệm (µM)	Hiệu giá HAD50 sau 24 giờ		Hiệu giá HAD50 sau 48 giờ
	HAD50	Độ giảm hiệu giá	HAD50	Độ giảm hiệu giá
20	107,13	0,34	106,13	1,34
40	107,13	0,34	105,80	1,67
Đối chứng dương	107,47		107,47

 

Kết quả bảng 3.3 cho thấy sau 24 giờ ủ Apigenin với virus DTLCP, hiệu giá của virus giảm từ 10^7,47 xuống 10^7,13 ở cả 2 mức nồng độ là 20 µM và 40 µM. Sau 48 giờ ủ Apigenin với virus DTLCP, hiệu giá của virus giảm từ 10^7,47 xuống 10^6,13 ở nồng độ 20 µM; còn ở nồng độ 40 µM thì hiệu giá virus giảm từ 10^7,47 xuống còn 10^5,80. Hình 3.1 thể hiện khả năng ức chế virus DTLCP của Apigenin sau 48 giờ. Ở mức nồng độ 20 µM và 40 µM, số lượng Rosetta hình thành ít hơn so với đối chứng một cách rõ ràng chứng tỏ lượng virus DTLCP đã bị ức chế đáng kể.

 

Hình 3.1. Khả năng ức chế virus Dịch tả lợn châu Phi của Apigenin sau 48 giờ

 

A: Đối chứng dương; B: Apigenin 20 µM; C: Apigenin 40 µM

 

4. KẾT LUẬN

 

Đã thử nghiệm tính gây độc với tế bào PAM của chín đơn chất, trong đó Apigenin, Genkwanin, Betulin, Tanshinon IIa và Maslinic acid không gây độc tế bào. Saponin gây độc tế bào ở nồng độ 150 µM. Allicin, Quercetin và Catechin gây độc tế bào ở nồng độ 200 µM.

 

Đã thử nghiệm khả năng ức chế virus DTLCP của các đơn chất, chỉ có Apigenin thể hiện khả năng ức chế virus DTLCP rõ nhất. Sau 48 giờ tác dụng, Apigenin làm giảm hiệu giá của virus DTLCP xuống 1,67 đơn vị HAD₅₀ từ 10^7,47 xuống 10^5,80.

 

Bùi Trần Anh Đào, Nguyễn Thị Lan, Bùi Thị Tố Nga,

Hoàng Minh Sơn, Nguyễn Thị Thanh Hà, Vũ Thị Thu Trà,

Trần Minh Hải, Nguyễn Thị Giang, Lê Văn Trường, Nguyễn Thị Hoa,

Hoàng Thị Phương, Trần Ngọc Thùy, Đặng Hữu Anh^*

^*: Tác giả liên hệ, sđt 0977832477, email: dhanh@vnua.edu.vn

 

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Amiri, S., Dastghaib, S., Ahmadi, M., Mehrbod, P., Khadem, F., Behrouj, H., Aghanoori, M. R., Machaj, F., Ghamsari, M., Rosik, J., Hudecki, A., Afkhami, A., Hashemi, M., Los, M. J., Mokarram, P., Madrakian, T., & Ghavami, S. (2019). Betulin and its derivatives as novel compounds with different pharmacological effects. Biotechnology Advances.

Haines, F.J., Hofmann, M.A., King, D.P., Drew, T.W. & Crooke, H.R. 2013. Development and validation of a multiplex, real-time RT PCR assay for the simultaneous detection of classical and African swine fever viruses. PLoS One, 8(7): e71019. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071019

Hakobyan, A., Arabyan, E., Avetisyan, A., Abroyan, L., Hakobyan, L., & Zakaryan, H. (2016). Apigenin inhibits African swine fever virus infection in vitro. Archives of virology, 161(12): 3445-3453.

Hakobyan, A., Arabyan, E., Kotsinyan, A., Karalyan, Z., Sahakyan, H., Arakelov, V., Nazaryan, K., Ferreira, F., & Zakaryan, H. (2019). Inhibition of African swine fever virus infection by genkwanin. Antiviral research, 167: 78-82. 

Lee, J., Lim, S., Kang, S. M., Min, S., Son, K., Lee, H. S., Park, E. M., Ngo, H. T. T., Tran, H. T. L. & Hwang, S. B. (2012). Saponin inhibits hepatitis C virus propagation by up-regulating suppressor of cytokine signaling 2. PloS one, 7(6), e39366.

Munagala, R., Aqil, F., Jeyabalan, J., & Gupta, R. C. (2015). Tanshinone IIA inhibits viral oncogene expression leading to apoptosis and inhibition of cervical cancer. Cancer letters, 356(2): 536-546.

Nguyễn Văn Dũng, Lương Thị Kim Châu, Nguyễn Thị Hồng Loan, Nguyễn Thị Phương, Phương Thiện Thương, Phan Tuấn Nghĩa, Bùi Phương Thuận (2015). Hoạt tính ức chế Pepsin và Protease HIV-1 của các cao chiết và hoạt chất Acid maslinic từ dược liệu. VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, [S.l.], v. 31, n. 2, june 2015. ISSN 2588-1140.

Pu, X., Ren, J., Ma, X., Liu, L., Yu, S., Li, X., & Li, H. (2015). Polyphylla saponin I has antiviral activity against influenza A virus. International journal of clinical and experimental medicine, 8(10), 18963.

Shojai, T. M., Langeroudi, A. G., Karimi, V., Barin, A., & Sadri, N. (2016). The effect of Allium sativum (Garlic) extract on infectious bronchitis virus in specific pathogen free embryonic egg. Avicenna journal of phytomedicine, 6(4), 458.

Song, J. M., Lee, K. H., & Seong, B. L. (2005). Antiviral effect of catechins in green tea on influenza virus. Antiviral research, 68(2): 66-74.

Weber, N. D., Andersen, D. O., North, J. A., Murray, B. K., Lawson, L. D., & Hughes, B. G. (1992). In vitro virucidal effects of Allium sativum (garlic) extract and compounds. Planta medica, 58(05), 417-423.

Wu, W., Li, R., Li, X., He, J., Jiang, S., Liu, S., & Yang, J. (2016). Quercetin as an antiviral agent inhibits influenza A virus (IAV) entry. Viruses, 8(1), 6.